MOE 抗体理性设计（01）如何正确准备抗原–抗体复合物？以 CNTO607–IL-13 为例

一、这篇教程解决什么问题在抗体药物的计算机辅助设计中我们经常需要分析抗体与抗原之间的相互作用例如抗体通过哪些氨基酸残基识别抗原哪些残基对抗体的结合可能比较重要能否通过氨基酸突变改善抗体的亲和力、稳定性或溶解性要回答这些问题首先需要一个可靠的抗原–抗体三维复合物结构。虽然蛋白质结构数据库Protein Data BankPDB提供了大量实验解析的蛋白质结构但这些结构并不一定能够直接用于分子模拟和能量计算。例如晶体结构通常不包含完整的氢原子信息还可能存在缺失原子、不合理的局部几何构象以及需要进一步确定的质子化状态。因此在开展抗原–抗体相互作用分析和突变设计之前通常需要进行结构准备Structure Preparation。本篇将以CNTO607 抗体与 IL-13 抗原的复合物PDB ID3G6D为例介绍如何在 MOE 中完成复合物加载、结构检查和 QuickPrep 预处理为后续结合界面分析及抗体优化建立基础。完成本篇后我们将获得一个经过预处理的抗原–抗体复合物结构。二、开始之前认识我们的研究对象2.1 CNTO607 和 IL-13 是什么IL-13Interleukin-13白细胞介素-13是一种参与免疫调节的细胞因子与哮喘及过敏性疾病相关。CNTO607是一种能够识别IL-13的单克隆抗体。研究发现CNTO607 存在溶解性方面的开发问题因此可以通过蛋白质工程寻找改善其性质的方案。本系列选择 CNTO607是因为它不仅具有实验解析的抗原–抗体复合物结构还可以用来研究抗体结合模式、关键残基以及突变优化。2.2 PDB 3G6D 中包含什么我们使用的 PDB 结构编号为3G6D。该复合物主要包含三个蛋白质组分链标识组成作用L抗体轻链Light Chain构成抗体 Fab 片段H抗体重链Heavy Chain构成抗体 Fab 片段AIL-13 抗原被抗体识别的目标蛋白这里的 H 和 L 分别表示抗体重链与轻链而 A 表示抗原链。需要注意3G6D 展示的是抗体的 Fab 片段与抗原形成的复合物而不是一整个完整的 IgG 抗体。此外该结构中还包含硫酸根离子SO₄²⁻等非蛋白组分。它们在 MOE 中可能作为独立的链或分子对象显示。小白提醒PDB 文件中的 Chain ID 是结构文件中的链标识不是规定所有抗体都必须使用 H、L、A 这三个名称。分析其他复合物时需要重新确认各条链的身份。三、在 MOE 中加载抗原–抗体复合物步骤 1打开 PDB 文件启动 MOE 软件在主界面右侧工具栏找到MOE | RHS | Open其中RHS 是 Right-Hand Side 的缩写表示 MOE 主窗口右侧的工具栏。在弹出的 Open 面板中找到结构文件3g6d.pdb.gz官方课程提供了两种文件来源课程配套文件夹datafiles中的3G6D.pdb.gz。MOE 安装目录下的示例文件$MOE/sample/mol/3g6d.pdb.gz。如果使用课程配套文件夹可以通过 Open 面板中的 CWDCurrent Working Directory按钮将当前目录设置为datafiles方便后续文件读取。选择文件后点击OK。步骤 2检查 PDB 导入选项选择文件后MOE 会弹出Load PDB File面板。该面板可以控制结构文件的导入方式包括Symmetry是否根据晶体学信息应用对称操作或生成相应组装体。Alternates如何处理存在多个可选原子位置的结构。Waters是否保留水分子。Hetero是否保留非标准残基、离子等杂原子组分。Connect根据结构信息确定化学键连接关系。对于本篇使用的 3G6D按照官方课程操作暂时保留默认设置直接点击OK。导入完成后MOE 三维窗口中会显示复合物结构。实践建议默认参数适合本次课程示例但并不意味着适合所有蛋白质。尤其是其他晶体结构可能需要选择合适的 Biological Assembly生物学组装体否则可能缺少真实结合所需的蛋白链。四、识别抗体与抗原的不同蛋白链在正式准备结构之前应该先确认已经正确加载了抗体重链、轻链和抗原。步骤 3使用 Sequence Editor 检查蛋白序列点击 MOE 主窗口中的SEQ按钮打开 Sequence Editor序列编辑器。Sequence Editor 将三维蛋白质结构对应的残基序列显示出来方便我们查看不同蛋白链。在本次示例中可以识别3G6D.L抗体轻链。3G6D.H抗体重链。3G6D.AIL-13 抗原链。在序列窗口中还可能看到硫酸根等非蛋白组分。如果希望只观察蛋白序列可以隐藏非蛋白链的显示。步骤 4使用 System Manager 管理不同蛋白链使用以下菜单打开系统管理面板MOE | RHS | SystemSystem Manager 可以管理当前系统中的蛋白链、显示状态及颜色。点击面板中的设置图标将 View 设置为Extended使各条链分别显示。为了后续便于观察建议将抗原链3G6D.A设置为金黄色并让抗体重链和轻链使用不同颜色。这样我们就能够直观地区分抗体与抗原。五、使用 QuickPrep 准备复合物结构步骤 5打开 QuickPrep在 MOE 右侧工具栏中选择MOE | RHS | QuickPrepQuickPrep 面板打开后可以看到多个参数区域包括 Prepare、Delete、Tether、Fix 和 Refine。本篇先使用官方课程提供的操作设置不对所有参数逐一展开。为什么需要 QuickPrep虽然 PDB 数据库中的蛋白质结构通常来源于实验解析但实验结构并不意味着可以直接用于分子模拟和能量计算。受实验分辨率、结构解析方法及建模过程的影响PDB 结构中可能存在以下问题氢原子缺失常规 X 射线晶体结构通常难以解析完整的氢原子位置而氢原子及其质子化状态会影响氢键、静电相互作用和分子力学计算。原子或残基缺失部分柔性环区或侧链可能因电子密度不足而无法完整解析导致蛋白质结构中存在缺失原子或链断裂。局部结构不合理部分残基可能存在侧链取向不合理、Asn/Gln 翻转、原子间空间冲突等问题需要进一步检查和优化。质子化状态不明确Asp、Glu、His 等可电离残基的电荷状态可能受到 pH 和局部微环境影响需要根据计算条件确定合理的质子化状态。水分子和其他组分需要处理晶体结构中可能包含结晶水、缓冲液离子及其他非蛋白分子需要根据研究目的判断是否保留。生物学组装状态需要确认PDB 中的晶体不对称单元不一定等同于蛋白质实际发挥功能时的生物学组装体需要确认蛋白链的组成和相互作用关系。这些问题并不代表实验结构是错误的而是说明实验解析的结构模型与计算模拟所需的结构模型之间存在差异。比如这里就有缺失原子、结构不合理等问题。MOE 提供了QuickPrep功能将常见的结构准备操作整合在同一面板中。QuickPrep 可包含以下操作Structure Preparation检查和处理结构中的部分问题。Protonation根据计算模型确定质子化状态并添加氢原子。Water Treatment根据设置处理水分子。Tether / Fix对部分原子施加位置约束或固定。Refinement通过能量最小化改善局部几何结构。其中能量最小化的目的是在所选力场和约束条件下调整不合理的局部结构并不意味着可以自动得到蛋白质在真实生理环境中的唯一构象。步骤 6调整 Fix 参数在官方 3G6D 示例中需要取消勾选 Fix 选项然后点击 OK。这里要区分两个容易混淆的概念Fix将符合指定条件的原子固定不允许其在优化时移动。Tether使用位置约束限制原子偏离原始坐标的程度并非完全固定。因此取消 Fix 并不等于关闭所有约束也不等于让蛋白质进行不受限制的分子动力学模拟。本次取消 Fix是为了按照官方示例让相关原子参与结构优化而不是依据与配体的距离将部分原子固定。步骤 7运行结构准备点击OK后MOE 开始执行 QuickPrep。计算过程中MOE 主窗口会显示相应的计算进度信息。完成后进度提示消失得到经过预处理的复合物结构。具体计算时间取决于结构大小、所使用的参数和计算机性能。六、QuickPrep 完成后如何判断结构是否正常QuickPrep 正常结束不代表结构一定完全正确。在进行后续计算之前建议至少检查以下几个方面。1. 蛋白链是否仍然完整重新查看 System Manager 和 Sequence Editor确认抗体重链、轻链与 IL-13 抗原仍然存在。如果某条预期的蛋白链消失应检查导入设置和结构准备过程而不是直接继续计算。2. 复合物的整体构象是否发生明显异常比较结构准备前后的蛋白质构象。局部侧链位置和氢原子位置发生变化是可以预期的但如果出现明显的蛋白链分离、大范围构象变化或严重原子冲突则需要检查优化参数。3. 水分子与非蛋白组分是否发生变化QuickPrep 可以根据设置删除部分水分子或处理其他结构组分因此准备前后原子数量不一定完全一致。对于可能参与抗原–抗体结合的界面水分子应结合实际研究需求判断是否保留。4. 是否仍然存在缺失结构QuickPrep 不能保证修复所有类型的结构问题。对于较长的缺失环区或复杂的缺失片段可能需要额外的建模步骤。准备前准备后最后建议通过 MOE 的文件保存功能将准备后的结构另存为一个新文件例如3g6d_prepared.moe同时保留原始 PDB 文件避免覆盖实验结构。不同 MOE 版本的保存入口和选项可能有所不同按照当前版本的 File 菜单操作即可。七、常见问题Q1为什么在 PDB 中打开的蛋白质没有氢原子很多 X 射线晶体结构无法直接确定完整氢原子坐标因此 PDB 文件中可能缺少氢原子。MOE 可以在结构准备过程中添加氢原子并根据计算模型处理质子化状态。需要注意添加氢原子并不等于所有氢原子的位置和质子化状态都一定正确。Q2为什么 QuickPrep 前后的原子数量不同可能是由于添加氢原子、处理水分子、修复部分缺失原子或处理其他结构组分造成的。不能仅凭原子数量增加或减少判断结构准备是否成功。Q3取消 Fix 后为什么结构仍然没有明显变化Fix 与 Tether 是两种不同的限制方式而且能量最小化通常主要调整局部几何结构。取消固定选项并不意味着蛋白质一定会发生较大的整体构象变化。Q4QuickPrep 是否能够预测抗体和抗原如何结合不能。QuickPrep 的主要用途是结构准备和优化而不是预测两个蛋白质之间的相对结合位置。当抗体与抗原的结合模式未知时需要进一步使用蛋白–蛋白对接Protein–Protein Docking等方法。八、本篇小结本篇以 CNTO607–IL-13 复合物为例完成了抗体计算设计的第一步复合物结构准备。我们首先加载 PDB 3G6D并利用 Sequence Editor 和 System Manager 识别抗体重链、轻链及 IL-13 抗原。随后使用 QuickPrep 进行结构预处理并学习了 Fix、Tether 与能量最小化之间的基本区别。需要强调结构准备并不是一个单纯“点击 OK”的步骤。研究人员还必须检查处理后的结构确认复合物的组成和整体构象符合后续研究要求。至此我们已经获得一个可用于继续检查和分析的抗原–抗体复合物结构。下一篇预告MOE 抗体理性设计02如何识别抗体的 CDR 区域抗体的六个 CDR 都参与抗原结合吗下一篇将使用 MOE 的 Sequence Editor 对 CNTO607 进行 CDR 注释介绍 IMGT 等抗体编号体系并利用三维结构观察不同 CDR 与抗原之间的空间关系为后续 Protein Contacts 相互作用分析做好准备。参考资料Chemical Computing Group.Antibody Modeling and Protein Engineering. MOE 2024 Course主要参考第 4–14、20–23 页。Chemical Computing Group.Biologics: Protein Alignments, Modeling and Docking. MOE 2024 Course主要参考第 68–71 页。PDB 3G6DCNTO607–IL-13 复合物结构。本文根据 MOE 官方课程重新组织用于软件操作教学。截图以 MOE 实际操作画面为准。