200μl的枪头能做什么？能提高多模态单细胞空间蛋白质组通用性！
黄色的移液器枪头再普通不过了，用来吸取液体的呗。但是南方科技大学的田瑞军课题组用它来做“柱子”，开发了一种**离子交换蛋白质聚集捕获（iPAC）**技术，并结合多重免疫组化（mIHC）、流式细胞术、质谱分析技术，开发出多模态的空间蛋白质组技术平台：SCPro。
一、枪头变身吸附柱
离子交换蛋白质聚集捕获（iPAC）技术用于样本制备，以固相萃取为原理，将强阴离子交换膜片（SAX）和C18固相萃取膜巧妙的加入到离心枪头中。该技术的创新之处在于引入表面活性剂：十二烷基-β-D-麦芽糖苷，简称DDM。DDM可以避免纳克级的微量蛋白发生非特异性吸附，SAX膜片替代散装填的微球能提升蛋白捕获效率。
iPAC技术利用离子交换圆盘提升蛋白质捕获效率，原位蛋白质聚集捕获及优化的洗涤和洗脱步骤，显著提高了蛋白质鉴定的灵敏度和重复性，可以在处理复杂生物样本时获取高质量的蛋白质组数据。
iPAC技术流程图
二、iPAC样本制备步骤
· 制备裂解液：在收集得到的切片组织或分选细胞样本中添加20μL裂解缓冲液。4℃超声20个循环（工作30s，间歇30s）。
裂解缓冲液组成：1% DDM（w/v）、10mM HEPES（pH7.4）、150mM NaCl、600mM盐酸胍、蛋白酶抑制剂
· 制备iPAC离心枪头：取实验室常用的200μL移液器枪头，依次装填2片C18膜片和2片SAX膜片。上样前用DDM包被缓冲液对枪头进行平衡，短暂离心。
包被缓冲液组成：0.1% DDM溶于氢氧化铵溶液
·将等体积的细胞裂解液与DDM包被液混合后上样。
·加入纯乙腈（ACN），室温孵育10min，使蛋白在SAX膜片上聚集。
· 充分洗涤：使用80%（v/v）乙腈进行两次的洗涤。
·用溶于20 mM碳酸氢铵（ABC）的50 mM二硫苏糖醇（DTT）对蛋白进行还原，37 ℃孵育30 min。
·酶解：向枪头中加入4μL消化缓冲液，避光37℃孵育3h。
消化缓冲液组成：含20ng/μL测序级胰蛋白酶、20ng/μL测序级Lys-C、10mM碘乙酰胺，溶剂为20 mM碳酸氢铵。
·加入60μL含1%（v/v）甲酸的1M NaCl溶液，将酶解后的肽段转移至C18膜。
· 脱盐：用60μL 1%（v/v）的甲酸洗涤2次。
·用60μL 80%（v/v）乙腈将纯化后的肽段洗脱至玻璃内插管中。
·肽段冷冻干燥至完全干燥，用于质谱分析。
三、iPAC性能验证
研究团队通过一系列严谨的实验全面评估了iPAC技术的性能。
首先是平行实验，比较HEK293T没有经过酶消化和经过酶消化的细胞裂解液的蛋白回收率。进样量都为5ng、10ng和20ng，分别鉴定出超过3000、4000和5000个蛋白群组。与5ng肽段相比，回收率均在60%以上，且随着细胞上样量增加，蛋白回收率升高。
接着研究人员通过流式分选获得的HEK293T细胞评估iPAC性能。关闭MBR算法条件下，10个分选细胞鉴定出的蛋白群组超过2000个，100个分选细胞超过5000个。各组内变异系数（CV，maxLFQ算法）的中位数低于10%。
研究人员通过小鼠脑组织HE染色切片进一步验证iPAC性能。与分选细胞相比，这些样本含有大量污染物。结果从边长20μm、50μm、100μm的方形组织样本中鉴定出的蛋白群组分别超过800、2000、3200个。样本按体积换算分别对应2.4、15、60个细胞。变异系数低于15%，具有良好的重复性。
用80%乙腈进行洗涤能显著增强iPAC的性能。以边长200μm的组织样本为例，增加乙腈洗涤步骤后，蛋白群组数量提升3倍，肽段数量提升8倍。变异系数中位数从26%下降至8.2%。定量重复性得到大幅提升。增加乙腈洗涤的iPAC样本，得到的肽段-谱图匹配数（PSM）显著升高，而样本总离子色谱强度不受影响。
研究人员将iPAC技术用于分析胰腺肿瘤组织切片中不同区域的蛋白群组，以确定其处理复杂生物样本的稳定性。胰腺癌细胞被肿瘤相关成纤维细胞（CAF）与免疫细胞包绕，异质性高，预后较差。从KPf/fC转基因小鼠模型新鲜冷冻组织切片上获取边长100μm的方形组织块（约100个细胞），分别采集腺泡区、淋巴结区及肿瘤区样本，结果稳定鉴定出2000个蛋白群组，定量重复性好。主成分分析（PCA）可有效区分同一张组织切片内的不同细胞类型。基于细胞轮廓和空间邻近关系，切割得到100个肿瘤细胞及其邻近基质细胞，并使用iPAC进行空间蛋白质组分析，结果能深度解析空间蛋白质组，并重现其生物学特征。
iPAC技术验证过程。b: 纳克级HEK293T细胞裂解物结果；c: 流式分选结果；d: 小鼠脑H-E切片结果；e-g: 延长洗涤条件对iPAC性能的影响；h-j： 胰腺癌组织验证结果。
四、SCPro平台介绍
iPAC技术解决了SCPro平台的微量细胞样本处理难题，尤其是FFPE组织切片可能的污染问题。FFPE会将疏水的化学染料、表面活性剂等带入组织裂解液，破坏色谱分离性能，严重干扰质谱检测的灵敏度。本研究还自制内径50μm在喷针末端带有短筛板的零死体积（ZDV）色谱柱，提高电离效率（达到100nL/min）。
通过商业化软件的细胞核和细胞膜识别算法，SCPro平台能够对厘米级的mIHC切片上的单细胞轮廓进行精准界定，不需人工手动标注。通过设置不同显微镜下的参考形状，实现高倍成像与低倍实时成像间的转换，保证了细胞分割的准确性和高效性。利用粘性帽收集技术，在明场可视化条件下对单细胞无损失自动捕获。
为提升细胞类型分辨率，研究人员对流式细胞术分选的14种胰腺肿瘤微环境主要细胞类型进行蛋白质组分析，获取细胞类型特异性蛋白质组数据。以此为参照，运用空间去卷积算法对空间蛋白质组数据进行深度解析，从而更精确地推断不同组织位置的细胞组成和比例，挖掘潜在的细胞亚型信息。
SCPro平台的原理与工作流程
五、SCPro平台用于胰腺癌
微环境的深度洞察
KPf/fC小鼠的FFPE切片能重现正常胰腺细胞经上皮内瘤变，发展成胰腺导管腺癌（PDAC）的转变过程。研究团队选择单张组织切片能体现此过程的样本，制成4μm厚的切片，进行4色mIHC染色，在一张厘米级的mIHC全切图像上重现胰腺肿瘤微环境内各类细胞和病理特征的空间分布。
高分辨率的多色成像数据，清晰呈现了PDAC发生发展过程中不同细胞类型的空间分布变化，包括正常的腺泡细胞、胰腺上皮内瘤变细胞（PanIN）、PDAC细胞（EpCAM+）、免疫细胞（CD45+）、成纤维细胞（αSMA+）。在PanIN和PDAC均能观察到成纤维细胞富集区和匮乏区的特异性分布。CD45+细胞在肿瘤微环境内部与瘤周淋巴结具有不同的空间分布。根据表面标志物表达水平及细胞形态，筛选出6处体现胰腺肿瘤微环境空间分布异质性区域。在PDAC发生发展过程中，EpCAM+细胞周围的CD45+免疫细胞与αSMA+成纤维细胞占比逐渐升高。而随着与肿瘤细胞距离的增大，免疫细胞和成纤维细胞占比下降。结果说明CAF与抑制性免疫细胞聚集会形成基质屏障，造成PDAC预后不良。
空间蛋白质组结果显示，腺泡细胞、PanIN和PDAC细胞的蛋白质表达图谱差异显著，正常细胞与肿瘤细胞间存在异质性。腺泡细胞中与消化功能相关的蛋白质如Cpa1表达较高。而PDAC细胞中则富集肿瘤相关通路（如伤口愈合和线粒体翻译）的蛋白。这与细胞的生物学功能紧密契合，为深入理解胰腺肿瘤发生机制提供了重要线索。比如促进胰腺炎症、驱动腺泡细胞向PanIN进展的Reg3g蛋白表达升高，说明与肿瘤毗邻区域的腺泡细胞预后不良。
肿瘤微环境内部（IT）与肿瘤周围淋巴结（LN）区的CD45+免疫细胞存在显著差异。IT富集髓系细胞标志物Adgre1、C1qb、C1qc、Siglec1等，LN富集淋巴系细胞标志物Cd3d、Cd4、Cd8b、Cd79b等。相关功能分析也各具特色，进一步说明免疫细胞在不同空间位置的异质性。
SCPro借助空间反卷积解析PDAC肿瘤微环境，系统性挖掘不同组织位置的细胞类型组成。本研究共得到14种不同类型的细胞，包括CAF（myCAF、iCAF、apCAF），9种免疫细胞亚群：巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、髓系细胞、DC细胞、B细胞、CD8+ T、CD4+ T、Treg，以及肿瘤细胞。
差异表达蛋白热力图符合预期丰度的谱系标志物，如胰腺癌细胞标志物（Epcam、Msln、Krt19）、CAF 标志物（Fap、Dcn、Vim）、淋巴系细胞标志物（Cd4、Cd8、Cd19）以及髓系细胞标志物（Itgam、S100a8、Cd74）。GO功能分析揭示四大细胞谱系各自的功能特征，肿瘤细胞线粒体翻译通路富集，CAF中细胞外基质组装、细胞外结构组装通路富集，这与CAF通过分泌细胞外基质、生长因子及趋化因子推动肿瘤发展的功能完全吻合。
研究人员还对CD45+免疫细胞的组成和占比进行深入分析。用Tangram反卷积法分析IT和LN区域内14种流式分选细胞亚群的占比，并与mIHC结果进行比对。mIHC共染标志物包括Krt19（肿瘤细胞）、CD11b（髓系细胞）、CD3（淋巴系细胞）及DAPI。结果证实算法与成像结果吻合，具备可靠性。空间反卷积结果还显示，在肿瘤微环境中，髓系细胞在CD45+免疫细胞中占比高，而CD8+ T细胞和DC占比较低。说明胰腺肿瘤微环境主要被具有免疫抑制功能的髓系细胞浸润包绕。
结语
总结上文，SCPro平台在空间蛋白质组学层面的技术进展主要包括：
·建立一套普适的基于多色成像的细胞分割工作流程，在单张福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片上对多种细胞类型开展精准的空间蛋白质组分析，且无需耗费大量人力对细胞轮廓进行手动标注。
·构建用于细胞轮廓配准的参考模板，实现盖玻片下高质量多重成像与揭除盖玻片后激光显微切割（LMD）实时成像之间的定位信息迁移，提升LMD系统的细胞类型分辨率。
·可视化条件下，通过直接按压在薄膜载片上的粘性收集帽完成切割后细胞轮廓的稳定收集，不会造成样本损失。
依托上述技术优势，SCPro显著提升了基于激光显微切割的空间蛋白质组学的检测精度与检测通量。
单细胞分辨率的空间蛋白质组分析需要对FFPE样本进行纳克级处理。iPAC技术保障了平台检测的灵敏度和通用性。基于固相萃取的iPAC在蛋白捕获后增加多步洗涤步骤，可以去除染色组织样本中的化学染料及其他非蛋白类杂质。
参考文献：
Yanfen Xu, et al. Multimodal single cell-resolved spatial proteomics reveal pancreatic tumor heterogeneity. Nature Communications, 2024. https://doi.org/10.1038/s41467-024-54438-0